Centro de Espectrometria de Massas de Biomoléculas
Sobre nós
O Centro de Espectrometria de Massas de Biomoléculas (CEMBIO) inaugurado em 2012, tem caráter multidisciplinar e infraestrutura multiusuária. Dispõe de equipamentos modernos e de alta tecnologia. Desempenha um papel crucial ao viabilizar, aprimorar e promover pesquisas científicas e tecnológicas. Seu objetivo é apoiar pesquisadores da UFRJ, de outras instituições de pesquisa e do setor privado, contribuindo para o avanço científico e tecnológico. Além disso, o CEMBIO busca fortalecer a pesquisa básica e aplicada em diversas áreas do conhecimento no Brasil, ajudando a consolidar o desenvolvimento científico e tecnológico nacional.
Gestão
Wagner Barbosa Dias (coordenador)
Possui graduação em Ciências Biológicas- UFRJ (obtida em 1999), doutorado em Ciências Biológicas no Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho-UFRJ (obtido em 2004), e pós-doutorado (2005-2008) no departamento de Química Biológica da Johns Hopkins University, EUA. Atualmente é Professor Associado do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho-UFRJ. Tem experiência na área de Glicobiologia, atuando principalmente nos seguintes temas: 1. Sinalização celular envolvendo O-GlcNAc; 2. Importância de O-GlcNAc na tumorigênese; 3. Estudos sobre o metabolismo de glicose em câncer; 4. Estudos envolvendo O-GlcNAcilação em doenças crônicas.
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Livia Carvalho Barbosa (tecnóloga)
Possui graduação em Ciências Biológicas pela Universidade Federal do Rio de Janeiro (2005), mestrado e doutorado em Ciências Biológicas – Biofísica pela Universidade Federal do Rio de Janeiro (2008 e 2012). Tem experiência em Biologia Molecular e Espectrometria de Massas atuando no desenvolvimento e aplicação de metodologia analíticas em amostras biológicas e químicas com ênfase em Lipidômica, Proteômica e MALDI-Imaging.
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Isadora de Araújo Oliveira (tecnóloga)
Possui graduação em Ciências Biológicas Modalidade Médica pela Universidade Federal do Rio de Janeiro (2011), mestrado (2013) e doutorado (2017) em Ciências Biológicas (Biofísica) pela Universidade Federal do Rio de Janeiro. Tem experiência em Bioquímica e Espectrometria de Massas atuando no desenvolvimento e aplicação de metodologia analíticas em amostras biológicas e químicas com ênfase em Metabolômica, Glicômica e MALDI-Imaging.
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PORTARIA Nº 6810, DE 14 DE JULHO 2016.
O Diretor do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro, Professor Celso Caruso Neves, no uso de suas atribuições, resolve nomear o Comitê Gestor do Centro de Espectrometria de Massas e Biomoléculas – CEMBIO, constituído pelos seguintes docentes:
• Profa. Eliana Barreto Bergter – Instituto de Microbiologia Prof. Paulo Góes (IMPPG)
• Prof. Carlos Alberto Manssur Fraga – Instituto de Ciências Biomédicas (ICB)
• Profa. Yraima Cordeiro – Faculdade de Farmácia (FF)
• Profa. Bruno L. Diaz – Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho (IBCCF)
• Profa. Tânia Maria Ruffoni Ortiga (IBCCF) – Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho (IBCCF)
• Profa. Jennifer Lowe – Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho (IBCCF)
• Prof. José Roberto Meyer Fernandes – Instituto de Bioquímica Médica (IBqM)
E o Comitê de Usuários:
• Profa. Adriane R. Todeschini – Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho (IBCCF)
• Prof. Lucio Cabral – Faculdade de Farmácia (FF)
• Profa. Marcela Cristina de Moraes – Instituto de Química da Universidade Federal Fluminense (UFF)
• Profa. Juliana Reis Cortines – Instituto de Microbiologia Prof. Paulo Góes (IMPPG)
• Profa. Georgia Correa Atella – Instituto de Bioquímica Médica (IBqM)
• Tecnólogos do CEMBIO
Capítulo I
Do órgão e sua finalidade
Artigo 1º – O Centro de Espectrometria de Massas de Biomoléculas, abreviado como CEMBIO, é uma central analítica trans-departamental que visa prestar serviços na área de espectrometria de massas e auxiliar as diversas linhas de pesquisa, apresentando como objetivos gerais:
I – Oferecer a comunidade acadêmica uma ferramenta confiável para desenvolvimento de projetos na área de pesquisa;
II – Atender todos os usuários de forma isonômica e oferecer qualidade e confiabilidade nos resultados entregues;
III – Ser auto-sustentável e, para isso, fazer o rateio dos custos de serviços realizados na unidade e de manutenção da sua estrutura, com o apoio administrativo de uma Fundação;
IV – Mapear a necessidade dos usuários e investir, sempre que possível, no aperfeiçoamento de toda estrutura.
Capítulo II
Da localização
Artigo 2º – O CEMBIO encontra-se na sala 31, no subsolo do Bloco C do Centro de Ciências da Saúde (CCS) da Universidade Federal do Rio de Janeiro, Ilha do Fundão.
Capítulo III
Do serviço prestado
Artigo 3º – O CEMBIO presta à comunidade científica serviços de análise de amostras diversas por espectrometria de massas, ressalvada a viabilidade técnica e operacional.
Artigo 4º – A interpretação de resultados e o planejamento experimental das amostras não fazem parte dos serviços prestados pelo CEMBIO, sendo esses de responsabilidade do usuário.
Capítulo IV
Da estrutura organizacional
Artigo 5º – A estrutura física do CEMBIO, bem como a aquisição dos espectrômetros de massas, é resultado do investimento e comprometimento de seis programas de pós-graduação da UFRJ, denominadas unidades mantenedoras, a saber:
I – Pós-graduação em Ciências Biológicas (Biofísica) do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho;
II – Pós-graduação em Ciências Biológicas (Fisiologia) do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho;
III – Pós-graduação em Microbiologia do Instituto de Microbiologia Paulo de Góes;
IV – Pós-graduação em Farmacologia e Química Medicinal do Instituto de Ciências Biomédicas;
V – Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas da Faculdade de Farmácia;
VI – Pós-graduação em Química Biológica do Instituto de Bioquímica Médica.
Artigo 6º – O Comitê gestor do CEMBIO é formado por membros representantes das unidades mantenedoras, e seus respectivos suplentes, da seguinte forma:
I – Coordenador geral do CEMBIO, docente pertencente ao Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho;
II – Docente indicado pela coordenação de pós-graduação em Ciências Biológicas (Biofísica);
III – Docente indicado pela coordenação de pós-graduação em Ciências Biológicas (Fisiologia);
IV – Docente indicado pela coordenação de pós-graduação em Microbiologia;
IV – Docente indicado pela coordenação de pós-graduação em Farmacologia;
V – Docente indicado pela coordenação de pós-graduação em Ciências Farmacêuticas;
VII – Docente indicado pela coordenação de pós-graduação em Química Biológica;
VIII – Tecnólogos lotados no CEMBIO.
Artigo 7º – O corpo técnico do CEMBIO é formado por técnicos e tecnólogos especializados na técnica de espectrometria de massas.
Artigo 8º – A renovação do comitê gestor ocorrerá a cada 3 anos, sem número limite para reconduções.
Artigo 9º – A escolha do coordenador geral do CEMBIO será feita pelo próprio comitê gestor, levando em consideração a sua qualificação técnica.
Artigo 10 – O coordenador Geral terá mandato com duração de três anos e pode ser reconduzido mediante aprovação do comitê gestor, sem número limite para reconduções.
Parágrafo único – A escolha do Coordenador Geral será submetida à aprovação do Conselho Deliberativo dos Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho (IBCCF).
Capítulo V
Dos deveres
Artigo 12 – Ao coordenador geral cabe:
I – Supervisionar o trabalho dos tecnólogos;
II – Responder oficialmente pelo CEMBIO;
III – Auxiliar os tecnólogos na aquisição de material, questões técnicas de manutenção dos equipamentos e outros aspectos relacionados ao gerenciamento da Unidade;
IV – Transmitir devidamente todas as questões pertinentes ao comitê gestor.
Artigo 13 – Aos membros do comitê gestor cabe:
I – Supervisionar e avaliar a gestão do coordenador geral;
II – Participar da constante melhoria da unidade no que diz respeito à qualidade e confiabilidade dos resultados;
III – Aprovar o acesso aos usuários e/ou colaboradores que desejem acompanhar as análises realizadas no CEMBIO;
IV – Deliberar sobre os assuntos e demandas que não estão contempladas pelo Regimento Interno do CEMBIO.
Artigo 14 – Aos tecnólogos cabe o gerenciamento do CEMBIO, caracterizado como:
I – Operação e manutenção ordinária dos equipamentos;
II – Manutenção e organização da unidade, com a aquisição de materiais e solicitação de serviços de manutenção necessários para tal;
III – Cadastramento dos usuários;
IV – Recepção e análise das amostras dos usuários nos equipamentos, bem como entrega de resultados;
V – Controle dos custos operacionais das análises;
VI – Comunicação e gestão financeira junto à Fundação de Apoio;
VII – Orientação dos usuários quanto as regras de funcionamento do CEMBIO, ao preparo de amostra e à viabilidade técnica das análises de interesse;
VIII – Proposição e implementação de novas metodologias de análise.
Parágrafo 1o. – É facultado aos tecnólogos o estabelecimento de colaborações científicas junto aos usuários, o que será considerada uma atividade independente de suas funções junto ao CEMBIO e, assim, não devendo prejudicá-las.
Parágrafo 2o. – As colaborações decorrentes das atividades ligadas diretamente ao CEMBIO deverão ser comunicadas e previamente autorizadas pelo coordenador do CEMBIO.
Capítulo VI
Do acesso
Artigo 15 – O acesso ao CEMBIO é restrito ao coordenador da unidade, aos técnicos e tecnólogos responsáveis pelo centro e pelos pesquisadores colaboradores, mediante aprovação prévia do Comitê Gestor.
Parágrafo único – O acesso é definido como livre trânsito nas dependências do CEMBIO. Pesquisadores colaboradores não terão livre acesso à sala dos espectrômetros de massas.
Artigo 16 – Os usuários não poderão acompanhar as atividades da unidade, salvo em caso de necessidade por questões técnicas, definidas pelos tecnólogos ou por determinação do comitê gestor.
Artigo 17 – O usuário que desejar acompanhar as análises de suas amostras ou desenvolver metodologias analíticas que demandem acesso contínuo ao CEMBIO deverá enviar um e-mail para o coordenador do CEMBIO com as justificativas devidas, a fim de serem encaminhadas ao comitê gestor para a apreciação deste.
Artigo 18 – A aprovação da demanda será condicionada aos seguintes critérios:
I – O usuário deve apresentar conhecimento prévio sobre espectrometria de massas e/ou cromatografia líquida, de modo a não onerar o tempo dispendido pelos tecnólogos e, consequentemente, as atividades do centro de forma geral;
II – O usuário deve estar presente apenas no desenvolvimento de método (enquanto as amostras ainda se caracterizem como “amostras teste”) e/ou se as análises demandarem seu conhecimento científico e técnico para a interpretação em tempo real do dado e/ou melhoramento do resultado obtido;
III – Não será admitida a presença de mais de 2 usuários acompanhando suas respectivas análises por dia;
IV – O usuário não deve prejudicar a rotina de atividades do CEMBIO, ou seja, a assistência ao usuário não deve impactar negativamente nos prazos estabelecidos de entrega de resultados;
V – Se os tecnólogos observarem o descumprimento de quaisquer dos critérios acima mencionados, tal fato será reportado ao coordenador do CEMBIO e, caso o descumprimento permaneça, caberá ao Comitê Gestor a tomada de providências cabíveis.
Capítulo VII
Dos usuários
Artigo 19 – As pessoas interessadas em serem usuários do CEMBIO deverão preencher formulário de cadastramento, disponível no site, no CEMBIO ou a ser disponibilizado por e-mail mediante solicitação.
Parágrafo 1º – Somente poderão se cadastrar como usuários responsáveis professores, pesquisadores, tecnólogos, tecnologistas de instituições de ensino e/ou pesquisa e funcionários de empresas.
Parágrafo 2º – Alunos de pós-graduação e quaisquer indivíduos vinculados aos usuários responsáveis previamente cadastrados constarão como usuários do CEMBIO.
Parágrafo 3º – A entrega de amostras por estes usuários será aceita pelos tecnólogos da unidade apenas mediante apresentação do formulário de solicitação de análise constando a assinatura dos usuários responsáveis.
Artigo 20 – Os usuários do CEMBIO serão identificados conforme número de CADASTRO contendo 08 algarismos distribuídos em 04 grupos de dois algarismos. Cada um deles representará respectivamente a classe do usuário, a instituição e pós-graduação do pesquisador, o código do pesquisador e o ID do orientado.
Parágrafo único – Existem 05 classes de usuários conforme a tabela abaixo:
Classe | Membros |
10 | Unidades mantenedoras do CEMBIO |
20 | Demais instituições da Universidade Federal do Rio de Janeiro |
30 | Instituições públicas externas de pesquisa |
40 | Instituições privadas de pesquisa |
50 | Outros |
Capítulo VIII
Dos pesquisadores colaboradores
Artigo 21 – Os pesquisadores colaboradores são pesquisadores que assessoram os usuários do CEMBIO em aspectos como preparação de amostras por espectrometria de massas e análises dos resultados.
Artigo 22 – Serão admitidos como colaboradores do CEMBIO pesquisadores com formação e experiência adequadas e ratificados pelo comitê gestor, sendo por este definidas as permissões de acesso e de atividades realizadas por aqueles.
Artigo 23 – É vedado aos pesquisadores colaboradores:
I – O uso independente dos espectrômetros de massas e cromatógrafos, sem prévia autorização do Comitê Gestor;
II – O uso de outros equipamentos e materiais sem autorização dos tecnólogos;
III – Responder pelo CEMBIO, bem como exercer a função dos tecnólogos;
IV – Prejudicar o funcionamento de rotina do CEMBIO.
Capítulo IX
Do rateio dos custos
Artigo 24 – Os custos de funcionamento do CEMBIO serão rateados entre os usuários, e serão estabelecidos com base no tipo de análise, no número de amostras e/ou no tempo de uso do equipamento.
Artigo 25 – O rateio é baseado em estimativas feitas pelo coordenador e pelos tecnólogos do CEMBIO no que diz respeito ao consumo de reagentes e materiais e ratificado pelo Comitê Gestor.
Artigo 26 – As análises de usuários externos à UFRJ serão realizadas como prestação de serviço, com interveniência de uma Fundação de Apoio à Pesquisa, que administrará os recursos financeiros oriundos desta prestação.
Capítulo X
Do atendimento ao público
Artigo 27 – O horário de atendimento para recepção de amostras será afixado na entrada do CEMBIO, assim como constará nas regras de funcionamento da Unidade, e deve ser respeitado pelos usuários.
Parágrafo único – Atendimentos fora do horário estabelecidos devem ser feitos somente mediante marcação prévia de horário com os tecnólogos.
Artigo 28 – A entrega de resultados só poderá ser feita mediante apresentação de ficha de solicitação de análise, devidamente preenchida e assinada pelo usuário responsável pelo cadastro, no horário de atendimento do CEMBIO.
Parágrafo único – As amostras, cujo procedimento de análise não esteja estabelecido no CEMBIO, serão consideradas testes até que a análise esteja otimizada, não sendo consideradas no rateio a menos que os usuários solicitem os resultados dos testes.
Capítulo XI
Da liberação dos resultados
Artigo 29 – Os resultados gerados pelas análises somente serão enviados aos usuários após a quitação do valor investido para execução das mesmas, ou após o desconto em crédito pré-existente.
Artigo 30 – Os resultados serão enviados por e-mail ou gravados em mídia digital fornecida pelos usuários.
Artigo 31 – Os dados brutos das análises serão mantidos pelo CEMBIO por um prazo de até dois anos, sendo descartados após esse prazo.
Capítulo XII
Da forma de avaliação
Artigo 32 – O CEMBIO será avaliado periodicamente pelos usuários e pelas unidades mantenedoras representadas pelos membros do comitê gestor.
Parágrafo único – A avaliação levará em conta parâmetros como tempo de análise, qualidade do serviço e atendimento.
Artigo 33 – O comitê gestor avaliará anualmente o funcionamento do CEMBIO, aprovando ou não a gestão do coordenador geral.
Capítulo XIII
Disposições Gerais
Artigo 34 – Os usuários poderão solicitar resumo do balanço administrativo/financeiro para consulta.
Artigo 35 – Quaisquer questões não abordadas nesse Regimento Interno serão apreciadas e deliberadas pelo Comitê Gestor.
Espectrômetro de massas modelo Autoflex Speed, da Bruker Daltonics:
Fonte ionizadora MALDI com analisador TOF-TOF. Medição de massa exata de compostos e biomoléculas; análise de produtos biotecnológicos; identificação de proteínas em mistura.
Espectrômetro de massas modelo Amazon SL, da Bruker Daltonics:
ELECTROSPRAY com analisador ION-TRAP modelo Amazon SL. Análise qualitativa e quantitativa de moléculas orgânicas.
Fontes de ionização APPI e APCI estão disponíveis para este equipamento.
Espectrômetro de massas modelo Impact HD, da Bruker Daltonics:
ELECTROSPRAY com analisador Q-TOF modelo Impact HD. Medição de massa exata de compostos; análise de biomoléculas em geral; análise de produtos biotecnológicos; identificação de proteínas em mistura (análise proteômica).
Fontes de ionização APPI e APCI estão disponíveis para este equipamento.
Espectrômetro de massas modelo Solarix XR de 7 Tesla, da Bruker Daltonics:
Fonte ionizadora ELECTROSPRAY/MALDI com analisador FT-ICR de 7 Tesla. Medição de massa exata de compostos; determinação de fórmula química de compostos; análise de biomoléculas em geral; análise de produtos biotecnológicos; identificação de proteínas em mistura (análise proteômica); preparo e análise de cortes histológicos e superfície de materiais por MALDI-Imaging.
Fontes de ionização APPI e APCI estão disponíveis para este equipamento.
Fontes de ionização APPI e APCI disponíveis para os espectrômetro de massas modelo Solarix XR (FT-ICR), maxis Impact (qTOF) e Amazon (Ion-trap)
Sistema de cromatografia líquida de ultra alta pressão modelo Nexera X2 (Shimadzu Corp)
Equipado com forno e autoinjetor.
Sistema de cromatografia líquida de alta pressão modelo Prominence (Shimadzu Corp)
Robô para depósito de matriz para preparo de amostra para imageamento por espectrometria de massas.
Sistema de sublimação para depósito de matriz para preparo de amostra para imageamento por espectrometria de massas.
Criostato Leica CM 1860 UV para cortes em congelamento, da Leica Bisystems
Sistema de cromatografia líquida de nanofluxo modelo NanoElute II (Bruker)
Análise proteômica
Para utilizar o CEMBIO é necessário ser cadastrado no site https://cmdfa.biof.ufrj.br/plataformas/cembio/gestao/
O orientador responsável e os orientandos devem ser cadastrados para terem acesso ao formulário de submissão de amostra no site.
A entrega de amostras deve ser feita de segunda à sexta das 10:30 às 12:00 e 13:30 às 17:00.
No momento da entrega das amostras o usuário deve trazer também o formulário de entrega das amostras. O formulário deve conter os dados para emissão da nota de serviço e estar assinado pelo pesquisador responsável (aceitamos também um e-mail de anuência do orientador em substituição da assinatura).
Para experimentos mais complexos, sugerimos que o usuário agende uma reunião com os técnicos do CEMBIO (presencial ou virtual) para ter uma orientação melhor sobre as funcionalidades do CEMBIO.
As amostras serão descartadas 1 mês após o envio dos resultados. Assim, o usuário que quiser reaver as amostras deve fazê-lo antes desse prazo.
Para metodologias ainda não estabelecidas no CEMBIO aceitamos amostras como teste para determinar se será possível atender a demanda do usuário. Para enviar amostras como teste o usuário necessariamente deve requisitar uma reunião com os técnicos do CEMBIO. Amostras para teste não são cobradas.
Tenha cuidado para que o recipiente seja adequado à natureza de sua amostra, para evitar vazamentos ou perda da amostra durante o transporte e/ou durante a abertura do recipiente. Evite preencher todo o volume do recipiente (deixe pelo menos 20% de espaço vazio entre a tampa e o volume de amostra colocado).
Envie a quantidade de amostra adequada à técnica (vide abaixo).
Utilizar solvente grau HPLC ou grau HPLC-MS para o preparo das amostras (não utilizar solventes P.A. devido à presença de impurezas detectáveis no espectrômetro de massas).
Utilizar microtubo plástico de boa qualidade para não contaminar as amostras com polímero de plástico.
Quantidade de amostra necessária:
Proteína intacta – 5 a 10 μM em 50 μL
Proteína purificada para digestão – 5 μg
Extrato de proteínas para digestão – 100 μg
Bandas de gel de proteína – 10 μg (gel corado com corante compatível com espectrometria de massas ex.: coomassie coloidal)
Glicômica – 300 μg de proteína
Metabolômica e Lipidômica:
Tipo de amostra | Quantidade |
célula eucariótica | 1x10E6 células |
bactéria | DO600nm 5 |
plasma | 50 μL metabolômica e 100μL lipidômica |
tecido | 10 mg |
O desenho experimental, quantidade de replicatas, adição de padrão interno e necessidade de curva para quantificação ficam a critério do usuário.
Os resultados poderão ser acessados através de link para o Google Drive ou podem ser copiados diretamente no CEMBIO.
Os resultados de amostras submetidas como teste não serão enviados aos usuários. Os resultados serão acessados no CEMBIO presencial ou remotamente.
O CEMBIO só mantém os dados por dois anos. Recomendamos que seja feito o download dos dados após o recebimento.
O CEMBIO emite um relatório de preparo de amostra e aquisição dos dados. A interpretação dos resultados é de responsabilidade do usuário. Não emitimos laudo e não fazemos interpretação de resultados de LC-MS.
Adicionar as informações disponibilizadas no relatório de preparo e análise das amostras nos locais adequados entre colchetes.
- Injeção direta com Solarix – As amostras foram [descreva o preparo e diluição] e submetidas à análise por infusão direta no Solarix XR 7T, configuração ESI-FT-ICR (Bruker Daltonics). Os parâmetros foram ajustados como se segue: pressão do gás nebulizador [pressão], fluxo do gás de secagem [fluxo], temperatura de secagem [temperatura], voltagem do capilar [voltagem], end plate offset [voltagem]. Os espectros de massa foram adquiridos no modo [positivo e/ou negativo] na faixa de m/z [faixa de massas] e com time domain data set size [valor] MW.
Se tiver sido feita fragmentação de alvo escolhido: A fragmentação foi feita utilizando MRM utilizando uma janela de isolamento de [valor] m/z e com energia de [incluir informação de energia de fragmentação do relatório].
Se tiver sido feita fragmentação automática: A fragmentação foi feita utilizando DDA. Os [número] íons precursores mais intensos foram fragmentados com energia de [incluir informação de energia de fragmentação do relatório].
- Injeção direta com Impact – As amostras foram [descreva o preparo e diluição] e submetidas à análise por infusão direta no Maxis Impact [colocar sigla da fonte] -QTOF (Bruker Daltonics). Os parâmetros foram ajustados como se segue: pressão do gás nebulizador [pressão], fluxo do gás de secagem [fluxo], temperatura de secagem [temperatura], voltagem do capilar [voltagem], end plate offset [voltagem]. Os espectros de massa foram adquiridos no modo [positivo e/ou negativo] na faixa de m/z [faixa de massas].
- LCMS – As amostras foram [descreva o preparo, com solubilização e diluição] e submetidas à análise por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas, em sistema [Prominence ou Nexera X2 (Shimadzu)] equipado com coluna [nome da coluna, com dimensões e nome do fabricante], acoplado ao espectrômetro [nome do espectrômetro de massas] (Bruker Daltonics) com configuração [sigla da fonte e analisador (opcional)]. A separação cromatográfica foi feita com gradiente de fases móveis A [composição] e B [composição] como se segue: [descrever o gradiente]. A coluna foi mantida a [temperatura do forno] °C sob fluxo de [fluxo] mL/min. A saída da coluna foi acoplada ao espectrômetro de massas [nome do espectrômetro] equipado com fonte [tipo da fonte de ionização], cujos parâmetros foram ajustados como se segue: pressão do gás nebulizador [pressão], fluxo do gás de secagem [fluxo], temperatura de secagem [temperatura], voltagem do capilar [voltagem], end plate offset [voltagem]. Os espectros de massa foram adquiridos no modo [positivo e/ou negativo] na faixa de m/z [faixa de massas] a [velocidade de aquisição] Hz, usando aquisição [FullScan, DDA, DIA, MRM, ou outros].
Se foi feita fragmentação, incluir: Os [número] íons precursores mais intensos foram fragmentados com energia de [incluir informação de energia de fragmentação do relatório].
- NanoLC – Os peptídeos foram solubilizados em solução de 0,1% ácido fórmico em água para concentração de 0,5 μg/μL e foram injetados 1 μL utilizando o sistema de cromatografia líquida NanoElute II (Bruker Daltonics) equipado com coluna [nome da coluna, com dimensões e nome do fabricante] e pré coluna [nome da coluna, com dimensões e nome do fabricante]. A separação cromatográfica foi feita com gradiente de fases móveis A água com 0,1% de ácido fórmico e B acetonitrila com 0,1% de ácido fórmico como se segue: [descrever o gradiente]. A coluna foi mantida a [temperatura do forno] °C sob fluxo de [fluxo] mL/min. A saída da coluna foi acoplada ao espectrômetro de massas [nome do espectrômetro] equipado com fonte nanoESI CaptiveSpray (Bruker Daltonics), cujos parâmetros foram ajustados como se segue: pressão do gás nebulizador [pressão], fluxo do gás de secagem [fluxo], temperatura de secagem [temperatura], voltagem do capilar [voltagem], end plate offset [voltagem]. Os espectros de massa foram adquiridos no modo [positivo e/ou negativo] na faixa de m/z [faixa de massas] a [velocidade de aquisição] Hz, usando aquisição [FullScan, DDA, DIA, MRM, ou outros].
- MALDI – As amostras foram [descreva o preparo e diluição] então misturadas 1 : 1 com solução 10 mg/mL de [MBT, HCCA, DHB…] em [solução] então aplicada na placa de MALDI (1uL). As amostras foram analisadas no [Autoflex Speed MALDI – TOF ou Solarix XR 7T, configuração MALDI-FT-ICR] (Bruker Daltonics).
Autoflex – Os dados foram adquiridos em modo [positivo e/ou negativo] na faixa de m/z [faixa de massas]. com supressão de [valor] Da e modo [refletor ou linear] . Os dados foram processados e analisados no programa [FlexImaging, Scils, ou outro, com a versão].
Solarix – em modo [positivo e/ou negativo] na faixa de m/z [faixa de massas]. A potência do laser foi ajustada para [potência do laser] e cada espectro foi adquirido a partir de [número de tiros] tiros. Os dados foram processados e analisados no programa [FlexImaging, Scils, ou outro, com a versão].
- Imaging – [Amostra] foi coletada e emblocada em [meio de emblocamento] então congelada utilizando banho de gelo seco com acetona e guardadas em -80°C até o momento do corte. [Amostra] foi seccionada no criostato Leica CM1860 UV (Leica Biosystems) com espessura de [valor] μm e temperatura [valor] °C. Os cortes foram aderidos em lâminas de [dizer tipo de lâmina]. Guardadas em -80°C até o momento da análise. [Incluir modo de deposição de matriz, conforme opções abaixo]. Os espectros foram adquiridos em espectrômetro de massas [nome do espectrômetro] (Bruker Daltonics, Alemanha) com configuração [nome da fonte e do analisador, opcional] em modo [positivo e/ou negativo] na faixa de m/z [faixa de massas]. A potência do laser foi ajustada para [potência do laser] e cada espectro foi adquirido a partir de [número de tiros] tiros, com resolução lateral de [número] µm. Os dados foram processados e analisados no programa [FlexImaging, Scils, ou outro, com a versão].
Deposição de matriz por sublimação – A matriz [MBT, HCCA, DHB…] (300 mg) foi dissolvida em [solvente] e submetida a evaporação do solvente utilizando o aparato de sublimação (Chemglass Life Sciences; CG-3038-01). Em seguida a lâmina com as amostras foi submetida a sublimação por [valor] min a 50 mTor e [valor] °C.
Deposição de matriz por pulverização – A deposição de [nome da matriz] foi feita utilizando sistema adaptado, composto por agulha de fonte de ionização do tipo APCI (APCI Apollo II, Bruker Daltonics, Alemanha) conectada a bomba de seringa e uma fonte de nitrogênio gasoso, acoplada ao braço de impressora XY (AxiDraw V3). A solução de matriz [concentração e solvente utilizado], foi infundida a [fluxo] µL/h e nebulizada com fluxo de N2 a [pressão] psi por [tempo] min.
Referência da deposição de matriz por pulverização: Martins, G. R., Brum, F. L., da Silva, D. M. M. C., Barbosa, L. C., Mohana-Borges, R., da Silva, A. S. Preparation of Hard Palm Seeds for Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Imaging Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (196), e65650, doi:10.3791/65650 (2023).
- Digestão gel – As bandas de gel foram descoradas com 1 mL acetonitrila/bicarbonato de amônio 100 mM pH 8. As amostras foram reduzidas com ditiotreitol (DTT) 10 mM a 60 °C por 30 min e alquiladas com iodoacetamida 55 mM a temperatura ambiente por 30 min. Em seguida, as amostras foram digeridas com tripsina [fabricante] 1:100 (m/m), com incubação a 37°C por 18 horas. As amostras foram extraídas com ácido fórmico 0,1%/acetonitrila por duas vezes. As amostras foram purificadas utilizando extração por fase sólida, com ponteira empacotada com resina de fase reversa POROS 20 R2 (Thermo Fisher Scientific) então eluídas com 100 μL 0,1% ácido fórmico em água/acetonitrila 1:1 (v/v). Os digestos purificados foram secos utilizando centrifugação a vácuo e ressuspensos em [valor] μL de água/acetonitrila (97:3) com 0,1% de ácido fórmico para injeção em sistema LC-MS.
- Digestão solução – As amostras com [massa] μg de proteína foram desnaturadas a 80 °C por 15 min em solução de 10 mM de bicarbonato de amônio pH 8 e 0,05% RapiGest SF (Waters), reduzidas em 3 mM DTT por 30 min a 60 °C, carbamidometiladas em 9 mM de iodoacetamida por 30 min a temperatura ambiente protegidas da luz, e digeridas com [protease, fabricante e proporção] a [temperatura] °C por 18 h. As amostras foram acidificadas com 1% de ácido trifluoroacético (TFA) e incubadas a 37°C por 90 minutos, sendo centrifugadas a 14000 x g durante 30 minutos a 4 °C. As amostras foram dessalinizadas em ponteiras empacotadas com 200 μg de resina de fase reversa POROS 20 R2 (Thermo Fisher Scientific) e, então, eluídas com 100 μL 0,1% ácido fórmico em água/acetonitrila 1:1 (v/v). Os digestos purificados foram secos por centrifugação a vácuo e ressuspensos em [valor] μL de água com 0,1% de ácido fórmico para injeção em sistema LC-MS.
- Digestão proteômica – As amostras de [descreva a natureza das amostras] foram ressuspensas em [volume] μL 100 mM Tris HCl pH 8,6 com 1% deoxicolato de sódio (DOC) e submetidos à incubação a 60 °C por 10 min, seguida de sonicação por 15 s. Em seguida, foi feita dosagem de proteína com NanoDrop (Thermo Fisher) e [massa] μg de proteína de cada amostra foram precipitadas adicionando-se metanol (600 μL), clorofórmio (150 μL) e água (400 μL). Após a mistura dos solventes, as amostras foram vortexadas e submetidas à centrifugação a 14000 x g por 5 min à temperatura ambiente. A fase aquosa (superior) foi descartada e foram adicionados 450 μL de metanol. As amostras foram vortexadas e submetidas novamente à centrifugação. O sobrenadante foi descartado e o pellet protéico foi ressuspenso em 100 μL de tampão Tris-DOC. As proteínas foram reduzidas com DTT 10 mM a 60 °C por 60 min e alquiladas com iodoacetamida 20 mM a temperatura ambiente por 30 min protegidas da luz. Em seguida, as amostras foram digeridas com tripsina [fabricante] na proporção 1:30 (m/m) com incubação a 37 °C por 18 horas. As amostras foram acidificadas com 1% TFA, submetidas à centrifugação a 14000 x g por 1 min à temperatura ambiente e o sobrenadante foi coletado. Os peptídeos foram dessalinizados em ziptip C18, dosados com NanoDrop e secos por centrifugação à vácuo.
- Digestão com PNGase F e derivatização – As amostras foram desglicosiladas com [unidades de enzima] de PNGase F [fabricante] a 37 °C por 18 h. As amostras foram incubadas a 95 °C por 10 min, sendo posteriormente acidificadas com 1% TFA. Após a adição de [massa] de maltohexaose (Biosynth), as amostras foram centrifugadas a 14000 x g por 10 min à temperatura ambiente e o sobrenadante foi misturado à acetonitrila. Os N-glicanos liberados foram purificados em ponteiras com 30 mg de algodão. O eluído foi seco por centrifugação à vácuo e posteriormente submetido à derivatização com procainamida a 65 °C por 3 h em solução de ácido acético/DMSO 3:7 (v/v). Após a derivatização, as amostras foram submetidas à dessalinização e secas por centrifugação à vácuo.
Referência: Loponte HF, Oliveira IA, Rodrigues BC, Nunes-da-Fonseca R, Mohana-Borges R, Alisson-Silva F, Dias WB, Todeschini AR. Hyperglycemia alters N-glycans on colon cancer cells through increased production of activated monosaccharides. Glycoconj J. 2022 Oct;39(5):663-675. doi: 10.1007/s10719-022-10057-9. Epub 2022 Apr 5. PMID: 35380345.
Todo trabalho feito no CEMBIO deve incluir o seguinte reconhecimento: ” We thank Centro de Espectrometria de Massas de Biomoléculas for technical support .” O reconhecimento adequado das unidades multiusuário nos permite obter apoio financeiro e outros recursos para que possamos continuar a oferecer nossos serviços essenciais da melhor maneira possível. Agradecemos se você enviar uma cópia do manuscrito aceito, do artigo publicado ou o título do trabalho acadêmico para cembio@biof.ufrj.br. Isso nos permitirá demonstrar nosso impacto na comunidade.
Além disso, se algum membro da equipe do CEMBIO fizer uma contribuição intelectual e/ou experimental substancial para uma publicação, o reconhecimento como coautor é esperado. Isso é essencial para o desenvolvimento profissional de nossa equipe.
Recomendamos que os cientistas sigam as “Diretrizes Recomendadas pela ABRF para Autoria em Manuscritos”. (https://abrf.org/resources/authorship-guidelines/)
Bancos de dados:
Uniprot: https://www.uniprot.org/
The Human Metabolome Database: http://www.hmdb.ca/
LIPID MAPS Lipidomics Gateway: https://www.lipidmaps.org/
GNPS: https://gnps.ucsd.edu/ProteoSAFe/index.jsp
ChemSpider, chemical structure database: http://www.chemspider.com/
Consortium for Functional Glycomics: http://www.functionalglycomics.org/glycomics/molecule/jsp/carbohydrate/carbMoleculeHome.jsp
Lista de contaminantes comuns em MS: https://proteomicsresource.washington.edu/docs/protocols05/UWPR_CommonMassSpecContaminants.xls
Ferramentas online:
Mascot MS/MS search: http://mascot-server/mascot/cgi/search_form.pl?FORMVER=2&SEARCH=MIS
Peptide Mass, preditor de peptídeos gerados por digestão para sequenciamento de proteína: https://web.expasy.org/peptide_mass/
Softwares livres:
mMass, software para análise de espectros de massas: https://drive.google.com/
MZmine, software para análise de dados LC-MS: http://mzmine.github.io/
Skyline, software para análise de dados LC-MS: https://skyline.ms/project/home/begin.view?
Glycoworkbench, software para análise de glicanos: https://code.google.com/archive/p/glycoworkbench/
GlycoGenius, software para análise de glicanos: https://github.com/LoponteHF/GlycoGenius_GUI
Fundamentos de espectrometria de massas:
Tutorial MZmine:
No CEMBIO disponibilizamos as seguintes preparações de amostra:
- Digestão de proteínas em solução
- Digestão de proteínas em banda de gel SDS-PAGE
- Preparo para análise N-glicômica, incluindo: digestão com PNGase, purificação dos N-glicanos liberados e derivatização com procainamida ou 2-aminobenzamida.
Análise dos metabólitos extraídos de qualquer fonte biológica. Metabólitos polares totais são analisados em coluna de interação hidrofílica (HILIC) e apolares, em coluna de fase reversa. Utilizando HILIC com a metodologia do CEMBIO, conseguimos mais de 100 metabólitos em amostra de células eucarióticas, incluindo moléculas do metabolismo energético e redox.
É aconselhável a adição de padrão interno para normalização do rendimento da extração. O dado gerado fornecerá a informação qualitativa sobre os metabólitos. Para dados quantitativos, é necessário incluir padrões internos isotopicamente marcados (13C, 2H, por exemplo) e fazer a análise de uma curva de calibração em paralelo.
Análise dos lipídios extraídos de qualquer fonte biológica, analisados em coluna de fase reversa. Com a metodologia do CEMBIO, conseguimos detectar glicerofosfolipídios, ácidos graxos, glicolipídios, acilgliceróis (mono, di e triacilgliceróis) e esteróis em amostra de células eucarióticas (por exemplo).
É aconselhável a adição de padrão interno para normalização do rendimento da extração. O dado gerado fornecerá a informação qualitativa sobre os lipídios. Para dados quantitativos, é necessário incluir padrões internos isotopicamente marcados (13C, 2H, por exemplo) e fazer a análise de uma curva de calibração em paralelo.
Análise das cadeias de N-glicanos liberados de glicoconjugados de origem. Utilizando coluna HILIC (separação por caráter hidrofílico) ou GlycanPac (separação pelo número de ácidos siálicos) com a metodologia do CEMBIO, detectamos mais de 70 N-glicanos em amostra de células eucarióticas. Com o perfil de fragmentação, é possível a determinação estrutural.
É aconselhável a adição de padrão interno para normalização do rendimento da extração. O dado gerado fornecerá a informação qualitativa sobre os lipídios. Para dados quantitativos, é necessário incluir padrões internos isotopicamente marcados (13C, 2H, por exemplo) e fazer a análise de uma curva de calibração em paralelo.
Em breve
A abordagem proteômica é utilizada para identificar proteínas em misturas complexas. As proteínas são extraídas da amostra de interesse e digeridas com tripsina. Os peptídeos resultantes são separados por NanoHPLC e injetados no espectrômetro de massas. A corrida é feita no modo DDA (data dependent mode) em que o primeiro ciclo (MS1) é feito para a identificação da massa carga dos peptídeos (m/z). Então os espectros de fragmentação (MS2) desses vários peptídeos são gerados.
Com a metodologia do CEMBIO, conseguimos detectar 2000 proteínas em amostras de células eucarióticas.
As proteínas ou peptídeos em solução são submetidos a análise por espectrometria de massas de alta resolução. É necessário que a proteína esteja relativamente pura e sem glicerol e detergentes.
MALDI Imaging é uma ferramenta poderosa para mapear a distribuição de moléculas de uma amostra de tecido, variando de moléculas pequenas a proteínas grandes. Abaixo elencamos algumas de suas vantagens:
- Mapeamento de moléculas sem necessidade de marcação
- Imageamento de milhares de compostos em um único dado
- Identificação de diferenças moleculares específicas de uma região dentro de um tecido
- Integração perfeita com microscopia ou histologia
Atualmente o CEMBIO é capaz de analisar moléculas pequenas (lipídios e metabólitos polares) em cortes histológicos. O preparo de amostras para a análise dessas classes de moléculas envolve o congelamento em meio de emblocamento apropriado (gelatina e/ou carboximetilcelulose), seccionamento em criostato, coleta dos cortes histológicos em lâminas condutivas e deposição de matriz por sublimação ou pulverização. Trabalhamos com resolução espacial de 15 μm a 200 μm, ressaltando que quanto maior a resolução menor é a intensidade dos analitos.
É possível desenvolver novas metodologias de LC-MS desde que sejam compatíveis com os equipamentos disponíveis no CEMBIO. Entre em contato para tirar dúvidas.
Para acessar o sistema de cadastro e submissão de amostras, acesse o link abaixo:
https://cmdfa.biof.ufrj.br/plataformas/cembio/gestao
Contato: cembio@biof.ufrj.br
Endereço: Avenida Carlos Chagas Filho, 373, Bloco C (Subsolo) – Sala C0-031, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho (IBCCF) – CCS, Cidade Universitária – Ilha do Fundão, Rio de Janeiro – RJ, CEP: 21941-902.
